Elektroforesis? Apa Yang Anda Ketahui? Cari Jawabannya di Sini

133 0

Bagi anda yang bekerja sangat dekat atau tidak jauh dengan yang namanya Laboratorium, pasti sudah menjadi hal yang biasa berhdapan dengan yang namanya Elektroforesi bukan? Tidak adil rasanya jika hal ini tidak diketahui oleh orang banyak. Nah.. untuk itu kami disini hadir untuk anda dengan memberikan pengetahuan penting atau mengenal lebih dekat mengenai Elektroforesis. Tanpa basa-basi lagi, langsung saja kita simak penjelasannya yang ada di bawah ini. Ups.. Sebelum menjelaskannya lebih dalam, tidak ada salahnya untuk kita mecari tau apa sih arti dari Elektroforesis tersebut?

Definisi

Gel Elektroforesis adalah teknik yang digunakan di laboratorium untuk memisahkan molekul seperti DNA, RNA dan protein berdasarkan ukuran mereka.

Gel Elektroforesis dan DNA

  • Elektroforesis memungkinkan untuk membedakan fragmen DNA dengan panjang yang berbeda.
  • DNA bermuatan negatif,  ketika arus listrik menerapkan gel, DNA akan bermigrasi ke arah elektrode yang bermuatan positif.
  • DNA pendek bergerak lebih cepat melalui gel daripada fragmen-fragmen yang sedang disusun dalam urutan ukuran.
  • DNA pada gel dapat dilihat setelah mereka telah dipisahkan. Mereka akan muncul sebagai gel.
  • Penanda DNA dengan serpihan dikenal panjang biasanya dijalankan melalui gel pada saat yang sama sebagai sampel.

Gel Elektroforesis dan RNA

Kualitas keseluruhan persiapan RNA yang akan dinilai oleh Elektroforesis pada mendenaturasikan agarose gel,  ini juga akan memberikan beberapa informasi tentang hasil RNA. Mendenaturasikan sistem gel karena kebanyakan RNA membentuk struktur sekunder yang luas melalui pemasangan basa yang intramolecular dan ini akan mencegah dari migrasi ketat sesuai ukuran. Pastikan untuk menyertakan kontrol positif RNA pada gel sehingga hasil yang tidak biasa dapat dikaitkan dengan masalah gel atau masalah dengan RNA di bawah analisis.

Gel Elektroforesis dan protein

Seperti tegangan yang diterapkan, anion ( molekul bermuatan negatif) migrasi menuju elektrode positif (anoda) pada bagian bilik bawah, ion terkemuka adalah Cl− (mobilitas tinggi dan konsentrasi tinggi); glycinate adalah ion trailing (mobilitas yang rendah dan konsentrasi rendah). Partikel SDS, protein tidak bermigrasi bebas di perbatasan antara Cl gel buffer dan Gly buffer katoda. Friedrich Kohlrausch menemukan bahwa hukum Ohm juga berlaku untuk elektrolit terlarut.

Karena tegangan antara Cl dan Glycine buffer, protein yang dikompresi (tumpukan) ke dalam lapisan tipis mikrometer. Batas bergerak melalui gradien pori-pori dan tumpukan protein secara bertahap menyebar karena peningkatan hambatan gesek gel matriks. Susun dan unstacking terjadi terus-menerus dalam gel gradien untuk setiap protein pada posisi yang berbeda. Untuk protein lengkap, konsentrasi gel polyacrylamide harus melebihi 16%.

Elektroforesis protein adalah cara sederhana untuk memisahkan protein sebelum deteksi atau analisis. Portofolio produk Elektroforesis protein berkualitas tinggi menyatukan gel, protein gel, noda, molekul berat seperti spidol dan untuk percobaan analisis protein.

Sejarah

Pada tahun 1937, seorang ilmuwan Swedia yang bernama Arne Tiselius mengembangkan untuk mengukur gerakan molekul protein. Ini adalah alat yang berbentuk U yang menggunakan media yang berair untuk memisahkan molekul protein.

Pada tahun 1940, zona Elektroforesis diperkenalkan dengan  menggunakan media padat (misalnya gel) dan memungkinkan pewarnaan lebih baik resolusi atau visualisasi pemisahan molekul.

Kemudian pada tahun 1960, Elektroforesis kapiler dikembangkan untuk menyediakan suatu teknik Elektroforesis serbaguna. Jenis Elektroforesis memungkinkan pemisahan molekul menggunakan media berair dan padat.

Mengikat molekul

Elektroforesis menggunakan media yang sengaja berinteraksi dengan molekul dalam cara yang non-invasif. Sebagai contoh, gel mengikat molekul protein tanpa mengganggu struktur dan fungsi protein. Setelah mengikat molekul, gerakan atau pemisahan dimulai dengan menerapkan arus listrik. Selain itu, dimungkinkan juga untuk memulihkan molekul terikat setelah Elektroforesis.

Pemisahan resolusi tinggi

  • Elektroforesis dirancang untuk memvisualisasikan pemisahan molekul. Hal ini dicapai dengan berbagai cara, termasuk noda dan autoradiography.
  • Autoradiography menggunakan film X-ray untuk memvisualisasikan posisi radioaktif molekul (misalnya DNA) setelah pemisahan. Jenis visualisasi sebanding dengan mengambil gambar, dimana x-ray  seperti kilat kamera dan x-ray film adalah seperti film yang digunakan dalam mengembangkan foto hitam putih. Di Elektroforesis, foto-foto dari molekul seperti protein dalam darah Anda dikembangkan dengan menggunakan autoradiography.
  • Dalam pewarnaan, pewarna seperti coomassie biru dan hitam dicampur dengan molekul, sebelum atau setelah proses pemisahan. Sebagai contoh, pencampuran protein dengan coomasie pewarna sebelum Elektroforesis akan menghasilkan noda titik-titik kecil atau garis menampilkan gerakan protein selama pemisahan.

Analisis kuantitatif

Satu lagi tujuan Elektroforesis adalah untuk mendapatkan informasi kuantitatif setelah memvisualisasikan pemisahan molekul. Untuk mendapatkan data kuantitatif, misalnya gambar perangkat lunak (2D dan 3D) mencatat hasil Elektroforesis sebagai sinyal digital. Sinyal ini mewakili posisi molekul sebelum dan sesudah Elektroforesis dan kemudian digunakan untuk analisis kuantitatif.

Bagaimana Elektroforesis dilaksanakan?

Mempersiapkan gel

  • Gel biasanya digunakan untuk memvisualisasikan fragmen DNA. Konsentrasi agarose yang digunakan untuk membuat gel tergantung pada ukuran dari fragmen-fragmen DNA.
  • Semakin tinggi konsentrasi agarose, ini akan menjadi padat dan sebaliknya. Fragmen DNA yang lebih kecil dipisahkan pada konsentrasi yang lebih tinggi dari agarose sementara molekul yang lebih besar memerlukan konsentrasi yang lebih rendah dari agarose.
  • Untuk membuat gel, agarose atau bubuk ganggang merah dicampur dengan Elektroforesis buffer dan dipanaskan sampai suhu tinggi sampai semua serbuk agarose mencair.
  • Gel cair kemudian dituangkan ke dalam nampan gel dan ditempatkan pada salah satu ujungnya.
  • Setelah gel didinginkan dan dipadatkan Gel kemudian ditempatkan ke dalam sebuah tangki Elektroforesis dan penyangga Elektroforesis dituangkan ke dalam tangki sampai permukaan gel tertutup. Buffer melakukan arus listrik. Jenis buffer digunakan tergantung pada perkiraan ukuran dari fragmen-fragmen DNA dalam sampel.

Jenis-jenis Elektroforesis

Gel Elektroforesis umumnya digunakan sebagai identifikasi dan alat analisis.  Berbagai metode yang digunakan untuk memisahkan DNA, RNA dan protein.

Elektroforesis Agarose Gel

Agarose gel yang digunakan untuk menyortir molekul DNA dan RNA berdasarkan ukuran. Gel Agarose dapat bervariasi, berdasarkan ukuran molekul yang perlu terisolasi.

Elektroforesis SDS

Sodium lauryl sulfate, Elektroforesis polyacrylamide digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran. Protein digunakan untuk membuka atau didenaturasi menggunakan SDS deterjen dan mengarah pada gel polyacrylamide.

Gel Sequencing DNA

Didenaturasi DNA dapat berjalan di polyacrylamide gel, yang memungkinkan para ilmuwan untuk menentukan urutan molekul.

Elektroforesis Protein

Protein tetap dapat melipat dan mengarah pada gel untuk memisahkan mereka dengan massa dan muatan.

Elektroforesis Electrofocusing

Electrofocusing memisahkan protein berdasarkan pH.  Gel yang digunakan dalam jenis Elektroforesis memiliki pH gradien.

Apa yang menyebabkan Elektroforesis?

Gel Elektroforesis merupakan teknik yang digunakan untuk memisahkan dan menganalisis molekul. Teknik ini menggunakan arus listrik untuk memisahkan molekul berdasarkan ukuran molekul. Proses ini dapat digunakan pada molekul seperti protein dan asam nukleat (DNA and RNA). Jika dilakukan dengan benar, ketika Elektroforesis selesai, akan ada deretan gel yang baik.

  • Gel yang tidak semestinya

Menurut Rice University, jika gel tidak dituangkan dengan benar, itu tidak akan polymerize atau memperkuat merata, sehingga menyebabkan molekul jelek.

  • Overloading sumur

Sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur pada salah satu ujung gel. Jika sumur tersebut diisi terlalu banyak, atau jika sampel tidak benar diencerkan, sampel kelebihan mungkin smear di gel. Selain itu, jika gel dipindahkan setelah sample ditempatkan di dalam sumur, itu dapat menyebabkan sampel tumpah keluar dari sumur.

  • Sampel tidak semestinya

Ketika mempersiapkan sampel protein atau asam nukleat, itu dipecah menggunakan enzim yang memotong molekul di lokasi tertentu. Menurut “Pembatasan pencernaan atau Elektroforesis,” jika ini tidak dilakukan dengan benar, enzim dapat memecah molekul terlalu banyak, mengakibatkan mengolesi. Selain itu, memilih salah penyangga atau suhu juga dapat menyebabkan enzim untuk berfungsi dengan tidak semestinya, menyebabkan mengolesi.

  • Kontaminasi

Menurut “Asam nukleat Elektroforesis,” penyebab lain mengolesi adalah kontaminasi sampel. Sebagai contoh, sampel DNA yang dapat terkontaminasi dengan protein atau sampel protein dapat terkontaminasi oleh lemak.

Tujuan dari Elektroforesis

Ada berbagai alasan untuk melaksanakan Elektroforesis termasuk non-invasif mengikat molekul dan visualisasi pemisahan molekul. Secara keseluruhan, Elektroforesis bertujuan untuk memberikan cara yang akurat dalam menganalisis zat, seperti darah dan DNA (asam deoksiribonukleat), yang sulit untuk memisahkan menggunakan metode konvensional.

Beberapa faktor mempengaruhi Elektroforesis, termasuk biaya bersih, massa molekul, buffer dan electrophoretic media seperti kertas atau gel. Di Elektroforesis, molekul-molekul bergerak ke arah berlawanan. Sebagai contoh, protein dengan muatan positif bersih bergerak menuju sisi negatif dari media electrophoretic. Selanjutnya, molekul dengan massa lebih kecil bergerak lebih cepat atau daripada molekul dengan massa yang lebih besar yang terpisah.

Proses Elektroforesis

Molekul-molekul dipisahkan melalui arus listrik yang biasanya dikirim melalui gel. Gel ini sering digunakan untuk menunda partikel. Dua elektroda yang melekat pada gel digunakan untuk menarik molekul menuju salah satu bagian dari gel, sementara mereka tolak-menolak. Gel menyediakan kekuatan gesekan yang mencegah semua molekul-molekul bergerak, tapi molekul yang lebih besar  umumnya mengatasi gesekan. Pergerakan molekul melalui gel menciptakan jenis molekul yang berbeda.

Ada sejumlah faktor yang berbeda dari Elektroforesis dan masing-masingnya penting untuk menentukan jenis molekul yang sedang diperiksa. Seberapa cepat mereka bergerak, seberapa kuat arus listrik, kualitas yang tepat dari gel, bentuk molekul, ukuran molekul, suhu dan faktor-faktor lain.

Untuk menahan molekul dalam posisi mereka, mereka memiliki warna yang berbeda yang membuatnya tampak seperti serangkaian pita warna. Proses ini adalah salah satu langkah yang paling penting dalam analisis DNA, memungkinkan para ilmuwan untuk menarik keluar DNA dan protein dengan memeriksa erat untuk menentukan karakteristik khusus.

Bagaimana proses bekerja

Molekul organik sering memiliki muatan positif atau muatan negatif yang menyebabkan mereka untuk menanggapi arus listrik. Molekul dengan muatan positif bermigrasi ke arah negatif dan molekul dengan muatan negatif bermigrasi ke arah positif. Molekul  lebih cenderung untuk bergerak lebih cepat dan melakukan perjalanan lebih jauh.

Namun, mereka juga akan diperlambat oleh gesekan, yang pada gilirannya dipengaruhi oleh ukuran dan bentuk molekul maupun oleh media yang digunakan untuk pengujian. Dengan mengendalikan arus listrik dan gesekan yang disediakan oleh media tes, peneliti dapat membuat kondisi biomolekul terpisah yang efisien sehingga mereka dapat diisolasi. Hal ini juga memungkinkan para peneliti untuk mengidentifikasi perbedaan antara molekul dengan memperhatikan berapa banyak mereka sedang dipengaruhi oleh arus. Ini adalah alat yang berguna dengan berbagai aplikasi eksperimental dan biomedis.

  • Analisis DNA

DNA penting untuk konsistensi yang muatan negatif, yang berarti arus listrik berlaku kira-kira sama kuatnya untuk setiap bagian dari DNA. Di bawah tekanan, fragmen DNA yang lebih besar dan lebih kecil mulai memisahkan karena mereka dipengaruhi oleh gesekan dari jangak tes. Media gel biasanya sebuah gel agarose atau gel Akrilamida yang memungkinkan mereka untuk diteliti pada resolusi tinggi. Pewarnaan agen seperti ethidium bromida sering ditambahkan ke gel untuk membuatnya lebih mudah terlihat dan menafsirkan hasil.

  • Protein dan interaksi antibodi

Bentuk Elektroforesis lain adalah immunoelectrophoresis yang menganalisis kehadiran dan perilaku protein tertentu. Kondisi medis termasuk multiple sclerosis, penyakit ginjal dan beberapa jenis kanker mengakibatkan pembentukan molekul abnormal protein. Ini dapat dideteksi dengan melakukan Elektroforesis pada sampel urin atau darah dan untuk setiap varians dari jumlah normal dan jenis protein. Immunoelectrophoresis juga dapat digunakan untuk mendeteksi protein yang disebut imunoglobulin, yang bertindak sebagai antibodi.

Ini adalah bagian dari sistem kekebalan tubuh dan menyerang protein, seperti virus atau alergen. Menganalisis antibodi dapat membantu mengidentifikasi terapi untuk mengobati dan juga menyediakan wawasan tentang kondisi seperti alergi dan gangguan autoimun yang dapat merusak antibodi.

  • Pengujian antibiotik

Elektroforesis memainkan sejumlah peran dalam pengujian dari antibiotik. Salah satu yang paling umum adalah pengujian kemurnian antibiotik. Dengan menerapkan Elektroforesis larutan yang mengandung antibiotik dalam bentuk kertas, peneliti dapat membedakan antara antibiotik sendiri dan yang lainnya. Mereka juga dapat menentukan bagaimana terkonsentrasi antibiotik yang sangat penting untuk menerapkan dosis yang akurat. Penelitian antibiotik meluas ke dalam wilayah pengujian genetik, mengidentifikasi gen yang mungkin menunjukkan resistensi terhadap antibiotik tertentu.

  • Pengujian vaksin

Seperti antibiotik, Elektroforesis berguna dalam penciptaan dan produksi vaksin. Tujuan dari vaksin adalah untuk membantu tubuh menghasilkan antibodi terhadap patogen yang berpotensi berbahaya dan Elektroforesis adalah metode yang berguna untuk mendeteksi antibodi tersebut. Peneliti dapat menggunakan teknik untuk membandingkan efek vaksin atau beberapa versi vaksin di sejumlah besar subjek percobaan atau variabel lainnya. Setelah vaksin dalam produksi, Elektroforesis juga menyediakan cara yang cepat dan efektif untuk pengujian produksi konsistensi dan kemurnian.

Keuntungan dari Elektroforesis

Para ilmuwan menggunakan proses ini untuk memeriksa tubuh manusia dan spesies lainnya di tingkat genetik. Proses memisahkan komponen DNA untuk menentukan kehadiran pembuat genetik tertentu dan bahkan adanya gangguan dan penyakit. Akurasi pengujian telah memungkinkan sains untuk memetakan penanda genetik untuk berbagai gangguan darah termasuk anemia.

  • Fleksibilitas dalam identifikasi

Elektroforesis adalah tes diagnostik yang serbaguna yang dapat digunakan untuk pemisahan protein dan asam nukleat. Sistem ini sering digunakan dalam bidang medis untuk mendiagnosis berbagai gangguan genetik darah seperti anemia dan thalassemia atau kelainan darah. Elektroforesis juga telah digunakan untuk menentukan berbagai spesies ikan serta menentukan sifat-sifat berharga dari kedelai dan gandum dengan menganalisis dan memisahkan komponen DNA.

  • Akurasi hasil

Elektroforesis sangat akurat. Ketika proses yang dilakukan dengan benar, ini dapat memisahkan protein yang hadir dalam sel menjadi sebanyak 1.500 bagian yang berbeda. Sistem ini juga sangat selektif bahwa hal itu dapat melihat perbedaan dalam sampel DNA, bahkan jika sampel tersebut berbeda dengan dua pasang basis. Ini menyediakan hasil tes handal yang memungkinkan ilmuwan dan teknisi laboratorium untuk menarik kesimpulan tentang genetik spesies tanaman hardier, menentukan adanya kemungkinan penyakit dalam tubuh manusia dan mungkin suatu hari menghilangkannya pada tingkat genetik.

Kerugian dari Gel Elektroforesis

Sejak pembangunannya, teknik ini telah tak ternilai dalam mengidentifikasi gen (DNA) dan produk gen (RNA dan protein) untuk kepentingan penelitian. Dalam beberapa tahun terakhir, teknik-teknik baru telah muncul dengan  memberikan kekhususan dan rinci tentang apa yang terjadi dalam sistem kehidupan yang lebih besar. Penting untuk menyadari apa yang tidak bisa dan bisa dilakukan oleh gel Elektroforesis.

  • Pengukuran Elektroforesis tidak tepat

Gel Elektroforesis dapat secara efektif memisahkan protein serupa dengan berat yang berbeda. Ini dapat memisahkan mereka lebih tepatnya melalui teknik yang dikenal sebagai lektroforesis 2D.  Hal ini umum di proteomik.

Untuk memperoleh massa (berat) tepat protein, spektroskopi harus digunakan setelah protein yang telah dimurnikan oleh Elektroforesis. Selain itu, membandingkan jumlah relatif dari molekul yang berbeda bergantung pada kepadatan band (kegelapan) tempat yang berbeda pada gel. Metode ini memiliki beberapa tingkat kesalahan dan sampel biasanya dijalankan beberapa kali untuk mendapatkan hasil yang bersih.

  • Hanya molekul tertentu yang dapat divisualisasikan

Elektroforesis sangat baik dalam memisahkan dan mengidentifikasi biomolekul dari yang tingkat menengah hingga yang besar. Namun, banyak dari molekul yang peneliti berharap untuk melihat lebih kecil seperti homon, neurotransmiter dan ion yang tidak diukur oleh Elektroforesis. Hal ini karena dua alasan: Mereka benar tidak bereaksi dengan persiapan Elektroforesis dan bahkan jika mereka melakukannya, mereka terlalu kecil untuk memisahkan dengan baik dan akan terburu-buru keluar pada bagian bawah gel. Molekul-molekul ini bukan diukur dengan teknik seperti RIAAs (radio immunoassays) dan ELISAs (enzim-linked immunosorbant assay).

Prosedur laboratorium gel Elektroforesis

Elektroforesis gel adalah metode yang digunakan di laboratorium untuk mengukur dan mengurutkan DNA. Hal ini diperlukan karena DNA dalam kondisi normal terlalu kecil untuk memanipulasi, bahkan ketika dilihat menggunakan mikroskop. Gel Elektroforesis adalah prosedur yang relatif mudah dan teknik dasar yang sama dapat digunakan untuk memisahkan individu protein juga.

  • Matriks Gel

Untuk memulai Elektroforesis,  pertama-tama harus membuat gel. Biasanya, gel dibuat dalam lembaran tipis yang menggunakan suatu zat yang disebut agarose. Bubuk agarose ditempatkan dalam labu dan air garam yang disebut buffer. Campuran ini dipanaskan sampai dua zat meleleh bersama-sama, kemudian dituangkan ke dalam cetakan. Alat yang disebut sisir kemudian diletakkan pada salah satu ujung cetakan sebelum gel mendingin. Bila gel didinginkan, sisir akan dihapus, meninggalkan sedikit slot yang akan digunakan untuk menahan sampel DNA.

Karakteristik khusus campuran agarose (disebut matriks gel) berasal dari fakta bahwa itu diciptakan dengan air garam. Ketika listrik, matriks akan menjadi konduktif, memungkinkan listrik mengalir sepanjang-panjangnya. Properti khusus yang lain dari gel adalah adanya lubang biasa atau mikroskopis. Lubang ini akan memungkinkan DNA untuk mengarah melalui gel dan memfasilitasi proses penyortiran.

  • Chamber Elektroforesis

Langkah berikutnya adalah untuk menciptakan ruang Elektroforesis. Ini adalah kotak persegi panjang, dengan menyambungkan arus listrik positif dan negatif pada kedua ujung kabel.

Solusi air garam dituangkan ke bagian bawah ruang Elektroforesis, dan matriks gel tenggelam sedikit dalam solusi ini. Air garam melayani dua tujuan: membantu aliran listrik dan menjaga matriks gel lembab. Karena DNA adalah didorong oleh muatan negatif, tempat matriks Anda sehingga Anda sampel akan berlokasi di sebelah koneksi listrik negatif.

  • Mempersiapkan DNA

Menyiapkan Sampel DNA. Karena DNA dikatakan tidak terlalu sulit untuk dilihat. Agen ini sebagai solusi DNA, sehingga lebih dapat dilaksanakan. Menggunakan pipette, mentransfer sampel DNA ke dalam setiap gel. Dalam slot kosong antara setiap sampel, beberapa solusi DNA (disebut standar DNA) percobaan pengendalian dan perbandingan.

Fakta menarik untuk Gel Elektroforesis

  • Ketika mempersiapkan Elektroforesis agarose, terbaik untuk memercikkan agarose untuk mengatur suhu kamar, aduk dan diamkan setidaknya 1 menit sebelum dihangatkan. Hal ini memungkinkan agarose hidrat pertama, yang meminimalkan selama pemanasan.
  • Dapat melestarikan DNA dalam agarose gel untuk penyimpanan jangka panjang dengan menggunakan 70% etanol.
  • Migrasi DNA dapat terjadi ketika buffer terlalu banyak mencakup gel. Migrasi yang lambat hasil dari gradien mengurangi tegangan di gel.
  • Gel Electrophoresing terlalu panas dapat menyebabkan DNA untuk mengubah sifat sesuatu benda dalam gel. Juga dapat menyebabkan agarose gel cacad. Dinginkan gel dengan kipas angin kecil selama Elektroforesis.
  • Elektroforesis buffer dapat mempengaruhi resolusi DNA. Penyangga TAE (Tris-Acetate-EDTA) menyediakan lebih baik resolusi fragmen lebih besar dari 4 kb, sedangkan buffer (Tris-Borat-EDTA) TBE menyediakan lebih baik resolusi 0.1-3-kb fragmen. Selain itu, menggunakan TBE buffer ketika electrophoresing lebih besar 150 V dan penggunaan TAE buffer dengan supercoiled DNA untuk hasil terbaik.

Gays, dengan apa yang telah kami beritahukan diatas mengenai Elektroforesis dapat dijadikan sebagai sumber bacaan yang sangat bermanfaat serta berguna bagi banyak pembacanya. Demikian ini kami sampaikan dengan tujuan untuk lebih manambah ilmu pengetahuan. Semoga artikel ini dimana isinya dapat dipahami dan dimengerti. Selamat membaca.